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酶標儀實際上就是一臺變相的專用光電比色計或分光光度計，其基本工作原理與主要結構和光電比色計基本相同。圖示是一種單通道自動進樣的酶標儀工作原理圖。光源燈發出的光波經過濾光片或單色器變成一束單色光，進入塑料微孔極中的待測標本。該單色光一部分被標本吸收，另一部分則透過標本照射到光電檢測器上，光電檢測器將這一待測標本不同而強弱不同的光信號轉換成相應的電信號。電信號經前置放大，對數放大，模數轉換等信號處理后送入微處理器進行數據處理和計算，最后由顯示器和打印機顯示結果。
微處理機還通過控制電路控制機械驅動機構X方向和Y方向的運動來移動微孔板，從而實現自動進樣檢測過程。而另一些酶標儀則是采用手工移動微孔板進行檢測，因此省去了X，Y方向的機械驅動機構和控制電路，從而使儀器更小巧，結構也更簡單。 微孔板是一種經事先包理專用于放置待測樣本的透明塑料板，板上有多排大小均勻一致的小孔，孔內都包埋著相應的抗原或抗體，微孔板上每個小孔可盛放零點幾毫升的溶液。其常見規格有40孔板，55孔板，96孔板等多種，不同的儀器選用不同規格的孔板，對其可進行一孔一孔地檢測或一排一排地檢測。
酶標儀所用的單色光既可通過相干濾光片來獲得，也可用分光光度計相同的單色器來得到。在使用濾光片作濾波裝置時與普通比色計一樣，濾光片即可放在微孔板的前面，也可放在微孔板的后面，其效果是相同的。下圖便是目前常用的酶標儀光路系統圖。光源燈發出的光經聚光鏡，光欄后到達反射鏡，經反射鏡作90o反射后垂直通過比色溶液，然后再經濾光片送到光電管。
從酶標儀工作框圖和光路圖上可看出，它和普通的光電比色計有以下幾點差異:
(1)酶標儀通常不僅用A，有時也使用光密度OD來表示吸光度。 酶標儀可分為單通道和多通道2種類型，單通道又有自動和手動2種之分。自動型的儀器有X，Y方向的機械驅動機構，可將微孔板L的小孔一個個依次送入光束下面測試，手動型則靠手工移動微孔板來進行測量。 在單通道酶標儀的基礎上又發展了多通道酶標僅，此類酶標僅一般都是自動化型的。它沒有多個光束和多個光電檢測器，如 12個通道的儀器設有 12條光束或 12個光源，12個檢測器和12個放大器，在X方向的機械驅動裝置的作用下，樣品12個為一排被檢測。多通道酶標儀的檢測速度快，但其結構較復雜價格也較高。
(2)盛裝待測比色液的容器不再使用比色皿，而是使用塑料微孔板。微孔板常用透明的聚乙烯材料制成，對抗原抗體有較強的吸附作用，故用它作為固相載體。
(3)由于盛樣本的塑料微孔板是多排多孔的，光線只能垂直穿過，因此酶標儀的光來都是垂直通過待測溶液和微孔板的，光束既可是從上到下，也可以是從下到上穿過比色液
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